Один орган за раз: значительный прогресс в создании in vitro тканей человека для трансплантации

Но создание (выращивание) в лабораторных условиях сложных органов все еще остается работой, рассчитанной на десятилетия.
Исследования стволовых клеток — и инвестиции в них — во многом вдохновлены надеждой на использование стволовых клеток для регенерации, восстановления или замены поврежденных тканей и целых органов. Терапия на основе стволовых клеток обещает в конечном итоге решить проблемы, связанные с обычной трансплантацией органов: особенно отторжением тканей, нехваткой доноров и низким качеством донорских органов.

Значительно улучшенное знание факторов, необходимых, чтобы заставить стволовые клетки дифференцироваться в специализированные клетки, в сочетании с достижениями в области тканевой инженерии, приблизило эту мечту к реальности. Конкретные ткани и органы, полученные из стволовых клеток, теперь можно выращивать in vitro, а затем трансплантировать пациенту in vivo.

Ученые уже успешно трансплантировали относительно простые выращенные в лаборатории органы, такие как мочевой пузырь и дыхательная трубка, и в течение десятилетий проводили стандартную пересадку кожи и костного мозга.

Первые выращенные в лаборатории внутренние органы были пересажены в 1999 году в США, хотя о результатах не сообщалось до 2006 года, после отслеживания пациентов в течение нескольких лет. Эти первые трансплантации не включали специфическую дифференцировку стволовых клеток, но они установили, что выращенные в лаборатории органы можно трансплантировать и впоследствии они правильно функционировали.

Команда под руководством Энтони Атала, директора Института регенеративной медицины Уэйк Форест в Уинстон-Сейлеме, Северная Каролина, имплантировала выращенные в лабораторных условиях мочевые пузыри семерым детям с расщелиной позвоночника и сильно функционирующими мочевыми пузырями. Они извлекали клетки из неправильно функционирующих мочевых пузырей у детей и использовали их для разрастания тонких мешочков в лаборатории. Эти рудиментарные органы были затем перенесены обратно на собственные мочевые пузыри пациентов. Эта работа стала важной ступенькой и выдвинула на первый план необходимость, по крайней мере в настоящее время, какой-либо формы позвоночника или каркаса, чтобы обеспечить сигналы, необходимые для того, чтобы клетки организовались в соответствующие трехмерные структуры при дифференциации.

Первая пересадка органа, который был специально сгенерирован из собственных стволовых клеток пациента, произошла почти десять лет спустя в Университетском колледже, Лондон, Великобритания. Команда во главе с Мартином Бирчаллом, профессором ларингологии в Королевской национальной больнице горла, носа и ушей Великобритании, успешно вырастила трахею из стволовых клеток пациента и пересадила ее обратно пациенту. За этим достижением через 2 года последовала та же процедура для мальчика, который стал первым ребенком, получившим орган, созданным с помощью стволовых клеток, той же командой. «Мальчик нормально растет и учится в школе», — подтвердил Бирчалл.

Эти процедуры позволили использовать каркас для имплантации стволовых клеток; Команда Бирчалла использовала волокнистый коллаген из донорской трахеи. Чтобы избежать каких-либо проблем с отторжением, каркас был очищен от донорских клеток, чтобы гарантировать, что имплантированы только собственные клетки пациента. Бирчалл говорит, что с тех пор его команда провела еще четыре трансплантации трахеи, произведенных стволовыми клетками, в том числе один с использованием искусственного каркаса, чтобы избежать необходимости в донорском органе.

С точки зрения генерации и трансплантации in vitro органы входят в четыре категории возрастающей сложности, по словам Атала, который все еще работает над трансплантацией мочевого пузыря и расширил свою работу в другие твердые органы. «Во-первых, проще всего конструировать плоские структуры, такие как кожа, а кожа была первым «органом», созданным в лаборатории», — сказал он. Эта категория также включает в себя костный мозг, который был впервые трансплантирован в 1968 году для лечения младенца, страдающего от Х-сцепленной лимфопенической иммунной недостаточности. Эта ранняя процедура включала целый костный мозг, но более поздние процедуры только что трансплантировали стволовые клетки костного мозга.

«Среди твердых органов печень считается наиболее перспективной мишенью для регенеративной медицины».«Затем следующие по сложности трубчатые структуры, такие как кровеносные сосуды и дыхательная труба», — продолжил Атала. «В-третьих, полые органы, такие как мочевой пузырь и желудок, являются еще более сложными, потому что, в отличие от простых каналов, они должны работать совместно с соседними структурами, чтобы удерживать и выделять их соответствующим образом. Кроме того, наиболее сложными для конструирования органами являются твердые структуры, такие как почка, печень и поджелудочная железа, которые являются сложными, потому что они плотны с клетками и имеют высокие потребности в кислороде».

Среди твердых органов печень считается наиболее перспективной мишенью для регенеративной медицины. «Первым органом, который достигнет успеха в производстве in vitro и трансплантации, станет печень, потому что ее биология развития наиболее продвинута», — сказал Алехандро Сото-Гутьеррес, инструктор по исследованиям в отделении хирургии Университета Питтсбурга, США.

Ключевым шагом стала способность конструировать гепатоциты, которые составляют до 75% массы печени и выполняют большинство ее функций, включая детоксикацию и хранение белка, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Поскольку ИПСК происходят из нормальных соматических взрослых клеток и их количество потенциально неограниченно, они избегают этических проблем, связанных с использованием линий человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Кроме того, использование ИПСК позволяет использовать собственные клетки пациента, что значительно уменьшает проблему отторжения трансплантата.

По словам Сото-Гутьерреса, печень также легче пересаживать, потому что требуются только кусочки, а не весь орган. Орган обладает большой способностью самовосстанавливаться  после болезни и травмы — лучше, чем другие твердые органы, такие как сердце, почка или поджелудочная железа. Таким образом, функция печени может быть восстановлена ​​только путем пересадки кусочков печени, как это продемонстрировали на животных моделях Гутьеррес и его коллеги. «Прямо сейчас мы можем делать черновые трансплантаты in vitro с помощью биоинженерии и имплантировать их животным (крысам и свиньям), у которых есть нарушение обмена веществ или дефицит печени», — сказал он. «В основном, мы берем образцы через 2, 3 и 4 недели и демонстрируем полную функцию печени, поэтому мы набираем обороты».

Команда Высшей медицинской школы Йокогамского городского университета в Японии, возглавляемая Таканори Такебе, доцентом кафедры регенеративной медицины, добилась дальнейшего прогресса в создании тканей печени по двум направлениям. «Во-первых, мы создали крупномасштабную трехмерную самоорганизующуюся систему культуры ткани без помощи обычных каркасов, позволяющую множеству типов клеток взаимодействовать пространственно-временным образом, как это наблюдается в органогенезе», — объяснил Такеб. «Во-вторых, мы использовали новую концепцию дифференцировки iPSC, позволяющую пространственно-временную регуляцию многоклеточной коммуникации в ИПСК для получения полностью функционирующих клеток». Таким образом, Takebe и коллеги приблизились к эмуляции органогенеза in vivo, который зависит от молекулярных сигналов, определяемых относительной места дифференцировки и умножения клеток в данный момент времени. Более того, их подход преодолел еще одно критическое препятствие: подключение имплантированной ткани к сосудистой системе хозяина, чтобы он мог получать питательные вещества, необходимые для роста и развития. Команда Такебе обнаружила, что менее чем через 48 часов после трансплантации мышам трехмерная ткань, созданная в чашке Петри без каркаса, получила доступ к кровоснабжению хозяина.

Сото-Гутьеррес считает, что подобные разработки способствуют дальнейшему сотрудничеству, направленному на создание полностью функциональной печени, полученной из стволовых клеток. «Следующим шагом является объединение технологий, полученных из стволовых клеток и клеточной биологии, со знаниями в области трансплантации и биоинженерии, и создание человеческой печени», — сказал он. «Методы уже существуют, и нам просто нужно собрать их вместе». Он добавил, что эти методики также применимы для решения других, более сложных органов.

«Второй целью будет легкое, потому что вы все равно можете пересаживать одно легкое и иметь другое функционирующее», — сказал он. Третьим, по его мнению, будет сердце, хотя изначально не как целый орган, а, скорее всего, как дополнительный насос для оказания помощи.

По его словам, самая большая проблема будет заключаться в том, чтобы вырастить для пересадки почку, потому что орган более сложный и требует тесного сотрудничества между несколькими типами клеток. В то же время растет спрос на трансплантацию почек, поскольку заболевание почек является   проблемой для многих стран. Согласно исследованию 2010 года «Глобальное бремя болезней», хроническое заболевание почек заняло 27- е место в списке причин общего числа смертей в мире в 1990 году, но выросло до 18-го в 2010 году: примерно 16,3 на 100 000 человек.

Как и в случае с печенью, есть две половины проблемы роста почек. Джейми Дэвис из Центра интегративной физиологии при Эдинбургском университете в Великобритании занимается  тканевой инженерией для получения рабочих почек из почечных стволовых клеток. Его команда показала, что нефроны, генерируемые из одноклеточных суспензий, могут быть имплантированы и васкуляризованы, что, по словам Дэвиса, является важным шагом на пути к замене полной функции почек на тканевую инженерию почки.

«Работая с итальянскими коллегами, которые имеют опыт работы in vivo, мы показали, что искусственные почки будут подключаться к кровоснабжению и фильтровать кровь. В настоящее время мы проводим подробные физиологические измерения функции сконструированных почек». Каждая почка имеет около миллиона нефронов, которые являются как структурными, так и функциональными единицами, выполняющими фильтрацию и различные регуляторные функции почек, включая концентрацию мочи и регуляцию артериального давления.

Дэвис добавил, что также достигнут прогресс по включению мочеточника в искусственные почки, но эта задача оказалась неожиданно сложной. «Очевидно, что моча должна выходить, но эта, по-видимому, тривиальная особенность на самом деле неудобна для внедрения, потому что мы должны остановить остальную часть развивающейся почки, убеждая мочеточник стать еще более собирающим каналом».

Дэвис отметил, что другие команды добились столь же поразительного прогресса в создании необходимых человеческих почечных стволовых клеток из hESCs или iPSCs. «Достигнут устойчивый прогресс в разработке правильного набора факторов роста, обычно предназначенных для повторения нормальной последовательности развития», — сказал он. В качестве примера он привел недавно опубликованное австралийское исследование, но также предостерег от чрезмерной эйфории по поводу этого прогресса. «То, чего на самом деле достигает эта [публикация], это клетки, делающие небольшие трехмерные объекты в 3D-культуре, которые экспрессируют антигены, характерные для развивающихся нефронов. Это хорошая работа, но назвать то, что было достигнуто «самоорганизующейся почкой» вызовет нереальные ожидания общественности. Подобные вещи всегда заканчиваются тем, что возвращаются наново в область исследований, поскольку мы видим, что мы не выполняем того, что обещали наши ученые в целом».

Название австралийской статьи действительно является слишком амбициозной. Мелисса Литтл (Melissa Little) из Университета Квинсленда соглашается с тем, что для продолжения исследования функциональной почки в лабораторных условиях требуется гораздо больше исследований. «Мы должны показать доказательства дальнейшей дифференциации и изучить масштабы», — сказала она. «То, что мы показываем, это способность начать формирование развивающейся почки. Наиболее важным аспектом нашего исследования является то, что мы смогли одновременно индуцировать множественные подтипы почечных предшественников и показать, что они могут индуцировать друг друга с образованием почечных канальцев. Следовательно, мы можем начать получать структуры, похожие на развивающиеся эмбриональные почки, из эксплантов, содержащих клетки, все происходящие из человеческих плюрипотентных клеток».

Исследование проводилось с использованием преимущественно ЭСК, но дополнительные данные в принципе показывают, как техника может быть перенесена на ИПСК, что позволит развивающимся почкам соответствовать отдельным пациентам в отдаленном будущем. «Теоретически, этот подход может быть применен к линиям ИПСК, взятым от конкретных пациентов. Однако эта технология далека от клеточной терапии и может быть намного ближе к использованию в тестировании на наркотики».

Глаз является еще одним сложным органом, который становится центром терапии регенерации стволовых клеток. Это также очень сложно, так как он конкурирует или даже превосходит некоторые твердые органы с точки зрения сложности: он содержит стекловидное тело, придавая ему трехмерную структуру, и ряд узкоспециализированных эпителиальных, рецепторных и нейронных клеток в точно определенной архитектуре. Хотя целые глаза нужны редко, ключевые компоненты, такие как роговица, хрусталик или сетчатка, являются интересными целями для трансплантации. Таким образом, публикация японской команды в Центре биологии развития RIKEN в Кобе в 2009 году о первой дифференцировке in vitro ИПСК в прародители сетчатки, пигментные клетки эпителия сетчатки и фоторецепторы ознаменовала важный этап в создании критических типов клеток для этих тканей .

Другим органом, который привлекает много внимания, является сердце, учитывая его долгую историю трансплантации, которая восходит к знаменитой операции Кристиана Барнарда в Южной Африке в 1967 году. С тех пор трансплантация сердца стала относительно обычной и теперь превышает 4000 в год. Мировой прогноз также неуклонно улучшается: среднее время выживания составляет 11 лет. Но количество доступных донорских сердец ограничено и, как правило, исходит от пожилых людей, и поэтому они не находятся в наилучшем состоянии. Таким образом, ткани сердца, полученные из стволовых клеток, могут облегчить проблемы нехватки и качества, причем не обязательно как полные сердца, а как компоненты или пластыри для улучшения функциональности больного сердца в качестве альтернативы трансплантации.

Испанская команда во главе с Франциско Фернандес-Авилесом, главой кардиологии в Университете больницы Университарио Грегорио Мараньона в Мадриде, проверяла использование стволовых клеток для создания тканей, которые можно использовать для исправления поврежденной сердечной мышцы после болезни или инфаркта. «В частности, мы развиваем доклинические исследования на свиньях, в которых сердечные децеллюляризованные ткани заселяются различными видами стволовых клеток и помещаются поверх зоны инфаркта», — пояснил он. «Ожидается, что эта технология уменьшит площадь рубца и предотвратит развитие гипертрофии [утолщение стенок желудочковой камеры], что снижает эффективность работы сердца пациента».

Фернандес-Авилес предположил, что методы лечения, основанные на таких пластырях, скоро будут готовы к введению в клиническую практику, хотя необходимы дополнительные исследования, чтобы заставить их работать оптимально синхронно с остальным сердцем пациента: клетки сердечной мышцы должны действовать в гармонии, чтобы эффективно выполнять их функция перекачивания крови. «В то время как в печени или легких каждая отдельная клетка действует практически независимо, в сердце происходит сильное взаимодействие между клетками», — сказал Фернандес-Авилес. «Фактически, только синергия, вызванная электрической и механической связью между кардиомиоцитами (клетками сердечной мышцы), может привести к эффективному сокращению сердца. Это объясняет, почему несколько гепатоцитов могут воспроизводить почти все функции печени взрослого человека, хотя для достижения функционального выброса крови требуется целое сердце».

Чтобы решить эту проблему Фернандес-Авилес и его команда разработали жилет, который позволяет им картировать электрическую активность сердца пациента, чтобы идентифицировать рубцовую ткань. «Эта система позволяет характеризовать электрическую активность пациента быстрее, чем путем введения катетера, помогая в диагностике и планировании вмешательства», — пояснил он. Хотя еще пройдет несколько десятилетий, прежде чем из стволовых клеток пациента можно будет генерировать целые сердца. Фернандес-Авилес считает, что частичная замена через пластыри неизбежна и будет все больше востребовано в клинике, учитывая продолжающуюся нехватку донорских органов.

В отличие от него, Сото-Гутьеррес считает, что печень, полученная в лабораторных условиях, может стать доступной в течение всего лишь десятилетия, отчасти из-за присущих органу регенеративных способностей. Учитывая текущие темпы прогресса в исследованиях стволовых клеток и трехмерной тканевой инженерии, это не может быть преувеличением.